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技术支持

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常见问题解答

引物合成

Q:

PCR产物经克隆后测序发现,引物处的碱基有错误,怎么办?

A:

A15:因为引物纯度不可能是100%,因此,挑选克隆时,有可能挑选了杂质引物扩增出的PCR产物的克隆。此时,请重新挑选一个克隆测序,会得到正确的结果。如果挑选2 ~ 3个克隆测序情况还没改观,我们会免费重新合成引物并以最快的速度送到您的手里。如进行索赔时,按国际行业惯例,索赔范围限于制品价格范围之内。

Q:

能否根据引物电泳后EB染色后条带的亮度对合成的引物进行定量?

A:

A14:不能。因为EB是通过嵌入到核酸的双螺旋间而使其着色的。合成的DNA分子为单链,只有通过自身回折形成局部发夹环结构或链间形成部分双螺旋结构,才能被EB染色。由于不同引物的序列不同,形成双螺旋的能力不同,因此染色能力不尽相同,也就不能根据EB染色带的亮度来对合成的DNA进行定量。

Q:

合成的引物进行PCR反应时无目的条带,如何解释?

A:

PCR反应失败的原因很多,可以从以下几个方面考虑:引物和模板是否配对,同源性有多大;引物本身是否有立体结构;PCR反应用试剂是否能正常工作;PCR仪是否工作正常;PCR反应条件是否合适;如果一切正常,还无法解决问题时,我们可以免费重新合成引物。

Q:

使用3%Agarose凝胶电泳分析合成的引物,发现有很多条泳带?

A:

对引物进行电泳一定要使用变性PAGE电泳。由于引物是单链DNA,容易形成复杂的立体结构,因此进行Agarose电泳时,容易出现多条泳带,更无法用Agarose电泳进行定量了。

Q:

测定了引物的OD值后发现A260/A280<1.8,引物纯度合格吗?

A:

由于核酸在260nm附近有强吸收,而蛋白质在280nm附近有强吸收,从生物体内提取核酸时,常用A260/A280比值来评价核酸纯度(比值在1.8~2.0之间),这一判断是基于序列中A、G、C、T所占比例大致相同时的结果。而合成的DNA/RNA则不同,序列很短 (通常在20~30个碱基之间),其中A、G、C、T各种碱基所占比例很不相同,由于各种碱基的摩尔消光系数不同,因此不同碱基构成的引物的A260/A280比值也不同,例如当序列中C、T碱基的含量高时,该比值会大大低于1.8。所以不能用A260/A280的比值来判断引物的纯度。

Q:

一般合成的引物末端有磷酸基团吗?

A:

没有,5和3末端均为-OH基。如需要加磷酸基团,则需要使用修饰合成增加磷酸化。

Q:

如何检测引物的纯度?

A:

实验室方便的作法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的一定浓度的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳,<12个碱基的引物用20%的胶,12-60个碱基的引物用16%的胶,>60个碱基的引物用12%的胶,取0.2OD左右的引物,用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和,上样前加热变性(95oC,2mins)。加入尿素的目的一是变性,二是增加样品比重,容易加样。600V电压进行电泳,一定时间后(约2-3小时),剥胶,用荧光TLC板在紫外灯下检测带型,在主带之下没有杂带,说明纯度是好的(有时由于变性不充分,主带之上可能会有条带,乃是引物二级结构条带)。

Q:

为何长链引物的合成费用比短链引物的要高?

A:

通常在合成长链引物时,试剂的加入量要比短链引物多很多,尤其是大于90bp以上的引物,由于成本的增加,从而导致价格也要增加。

Q:

艾基生物可以为您合成多长的序列?

A:

150碱基以下。

Q:

如何计算oligo的摩尔数?

A:

1个OD值的Oligo的重量约为33 μg,而每个碱基的平均分子量一般按330道尔顿进行计算。因此, 合成oligo的nmol数一般按以下公式粗略地计算: nmole数=(OD值x33μg)/(碱基数x330)x1000=OD值/碱基数x100如果需要计算合成DNA的精确浓度,请按以下公式进行计算: nmole数=(OD值x1000)/[ (15.3xA#)+(7.4xC#)+(11.8xG#)+(9.3xT#) ]

Q:

oligo如何定量?

A:

用紫外分光光度计在260nm波长测定溶液的吸光度来定量,测定时溶液的吸光度最好稀释到0.2-0.8之间(吸光度太高或太低会有较大的误差)。DNA干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后,取部分溶液稀释到1ml并在1ml标准比色皿中测定其吸光度,即为所测体积的OD值,进而可以计算出母液的OD值。

Q:

oligo如何保存?

A:

没有溶解的引物非常稳定,可以在-20℃下保存至少1年,溶解好的引物可以事先稀释为100μmoL/L的储存液,分装数管保存于-20℃冰箱,可以保存至少半年以上(反复多次冻融会降低使用寿命)。使用前,将浓溶液稀释成工作液后进行实验。

Q:

oligo如何溶解?

A:

我们的合成报告单给出了每OD引物稀释为100μmoL/L(即100pmol/ul)浓度的加水量,您可以根椐您的实验需要加入适量的无核酸酶的双蒸水(PH>6.0)或TE缓冲液(PH 7.5-8.0),开启瓶盖溶解之前最好在3000-4000转/分钟的转速下离心1分钟,防止开盖时引物散失。

Q:

艾基引物纯化方式?

A:

纯化方式 详细说明 C18 柱脱盐 又称为简易反相柱,对DNA 有特异性吸附,可被有机溶液洗脱,但不会被水洗脱,因此能有效地去除盐分。 R-PAGE 基于特异或反向层析法, 从合成好的产物中去除失败序列,适于35 个碱基以下的引物。 PAGE 纯化 PAGE 纯化法是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,对引物DNA 进行分离,然后从凝胶中回收目的DNA。 HPLC 纯化 HPLC 纯化是使用高效液相色谱的原理,对引物DNA 进行纯化。该方法用于分离纯化或分析时能达到很高的纯度和灵敏度。常用的有离子交换HPLC 和反相HPLC。

Q:

引物是如何合成的?

A:

目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。DNA合成仪有很多种,无论采用什么机器合成,合成的原理都相同,主要差别在于合成产率的高低,试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。(1) 去保护:加入Deblocking脱去碱基上5'- OH的保护基团 DMT ,获得游离的 5'- OH;(2) 耦合:同时加入活化剂和新的碱基,新的碱基 5'- OH仍然被 DMT 保护,3' 端被活化与溶液中游离的 5'- OH发生耦合反应;(3) 封闭:耦合反应中极少数 5'- OH没有参加反应 ,用封闭试剂终止其后继续发生反应;(4) 氧化:加入氧化剂使其由核苷亚磷酸酯形成更稳定的核苷磷酸酯。合成后处理:切割与脱保护基:将合成好的寡核苷酸…

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