siRNA合成及靶点筛选

服务介绍  Service Introduction                                                    

        RNA干扰（RNA interference，RNAi）是一种高效特异的基因缺失性研究工具，是Andrew Fire 和Craig Mello在线

虫中发现的一种由双链RNA（dsRNA）介导的基因沉默现象，几乎存在于所有真核生物中。RNAi已经广泛应用于各种真

核生物的基因功能研究，药靶发现及药物筛选。近年来，多种临床试验表明靶向致病基因的RNAi药物具有治疗困扰人类多

年疾病的巨大潜力。

        小干扰RNA（short interfering RNA，siRNA，～ 21nt dsRNA），可以引起与之序列匹配的靶基因mRNA 的降

解，从而导致细胞或机体产生基因沉默的表型。锐博生物提供人、小鼠、大鼠及其他物种的siRNA设计与合成，包括细胞

使用用标准纯化siRNA、动物实验用in vivo siRNA、化学修饰siRNA、siRNA预制文库、定制型文库以及普通对照和荧光

转染对照，根据客户需求提供从从小规模到大规模的siRNA合成服务。

        艾基生物拥有成熟高效的基因合成平台，仅需提供目的核苷酸或氨基酸序列信息，即可人工合成任何您感兴趣的基

因，包括重复、发 夹、高 GC、毒性基因等困难基因序列，完全不受基因来源限制。另可依据密码子在不同宿主细胞的

偏爱性和不同的实验需求，提供免费 的密码子优化服务，提高您下游实验的成功率。

图 1 siRNA的作用原理示意图

图 2 siRNA产品包装盒

服务特色  Service Advantages

        常规化学合成siRNA多为19nt RNA+dTdT(3'悬垂)的RNA双链分子，未经任何化学修饰

        Sense：正义链，RNA，序列与靶序列相同

        Antisense：反义链，RNA，序列与靶序列互补

        dTdT：两端悬垂，DNA，均在3'端

        还支持各种特殊修饰或突变设计

图 3 siRNA结构示意图

代表性客户文章（siRNA相关） Articles

1 Lu, Y. et al. CLP36 promotes p53 deficient sarcoma progression through suppression of atrophin-1 

interacting protein-4 (AIP-4)-dependent degradation of YAP1. 

Theranostics 12, 5051-5068 (2022). https://doi.org/10.7150/thno.72365

2 Zheng, Y. et al. A pan-cancer analysis of CpG Island gene regulation reveals extensive plasticity within 

Polycomb target genes. 

Nat Commun 12, 2485 (2021). https://doi.org/10.1038/s41467-021-22720-0

3 Ye, F. et al. Osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells promotes c-Jun-dependent secretion 

of interleukin 8 and mediates the migration and differentiation of CD4(+) T cells. 

Stem Cell Res Ther 13, 58 (2022). https://doi.org/10.1186/s13287-022-02735-0

4 Chen, B. et al. Transmembrane nuclease NUMEN/ENDOD1 regulates DNA repair pathway choice at the 

nuclear periphery. 

Nat Cell Biol 25, 1004-1016 (2023). https://doi.org/10.1038/s41556-023-01165-1

5 Geng, Y. et al. FTO-targeted siRNA delivery by MSC-derived exosomes synergistically alleviates 

dopaminergic neuronal death in Parkinson's disease via m6A-dependent regulation of ATM mRNA. 

J Transl Med 21, 652 (2023). https://doi.org/10.1186/s12967-023-04461-4

6 Lin, X. et al. Activation of STING signaling aggravates chronic alcohol exposure-induced cognitive 

impairment by increasing neuroinflammation and mitochondrial apoptosis. 

CNS Neurosci Ther 30, e14689 (2024). https://doi.org/10.1111/cns.14689

7 Zhang, Y. et al. Glutamine suppresses senescence and promotes autophagy through glycolysis 

inhibition-mediated AMPKα lactylation in intervertebral disc degeneration. 

Commun Biol 7, 325 (2024). https://doi.org/10.1038/s42003-024-06000-3

8 Liu, Y. et al. SLC25A22 as a Key Mitochondrial Transporter Against Ferroptosis by Producing Glutathione 

and Monounsaturated Fatty Acids. 

Antioxid Redox Signal 39, 166-185 (2023). https://doi.org/10.1089/ars.2022.0203

9 Bao, J. et al. Upregulated TIMP1 facilitates and coordinates myometrial contraction by decreasing 

collagens and cell adhesive capacity during human labor. 

Mol Hum Reprod 29 (2023). https://doi.org/10.1093/molehr/gaad034

10 Hu, H. et al. Thrombospondin-1 Regulates Trophoblast Necroptosis via NEDD4-Mediated 

Ubiquitination of TAK1 in Preeclampsia. 

Adv Sci (Weinh) 11, e2309002 (2024). https://doi.org/10.1002/advs.202309002

FAQ

• 1. siRNA是什么？

   

      siRNA（small interfering RNA）是一类长度约为20-25个核苷酸的双链RNA分子。它在细胞中通过与互补的mRNA

      结合并诱导其降解，从而抑制特定基因的表达。

• 2. siRNA的作用机制是什么？

      siRNA的作用机制主要包括以下步骤：

      长双链RNA（dsRNA）被Dicer酶切割成21-25个核苷酸的siRNA，siRNA被整合到RNA诱导沉默复合体（RISC）中，

      在RISC中，siRNA的正义链被降解，反义链作为引导链，引导链与靶mRNA互补结合，RISC中的核酸酶切割靶

      mRNA，导致其降解，从而抑制基因表达。

• 3. siRNA有哪些应用？

   

      基因功能研究：通过特异性敲低基因表达，研究基因在细胞中的功能。

      药物靶点验证：用于验证潜在药物靶点的有效性。

      疾病治疗：理论上可以沉默任何与疾病相关的基因，用于治疗多种疾病。

      基因沉默工具：在基因沉默研究中被广泛应用。

• 4. 如何设计siRNA？

   

      选择GC含量在30%-52%的序列，避开5'和3'端的非编码区；比对基因组数据库，排除与其他编码序列同源的序列；合

      成多个靶序列的siRNA，筛选出最有效的序列；设计阴性对照siRNA，确保实验结果的可靠性。

• 5. siRNA转染方法有哪些？

   

      常见的siRNA转染方法包括磷酸钙共沉淀、电穿孔法、DEAE葡聚糖、机械法（如显微注射和基因枪）和阳离子脂质体

      试剂转染法。其中，阳离子脂质体试剂转染法是最常用的方法。

• 6. siRNA在体内应用面临的挑战有哪些？

  
  

      稳定性差：易被血液中的核酸内切酶水解。

      细胞膜渗透性差：带负电荷的siRNA难以穿透细胞膜。

      脱靶效应：可能干扰与靶mRNA部分同源的其他mRNA。

      免疫反应：过长的siRNA可能激活免疫反应。

• 7. 如何提高siRNA的稳定性和递送效率？

  
  

      化学修饰：通过糖修饰、磷酸盐主链修饰或碱基修饰提高siRNA的稳定性；

      使用递送系统：如纳米载体、适体、多肽、蛋白质和抗体等。

• 8. siRNA与miRNA的区别是什么？

  
  

      来源：siRNA是人工合成的，miRNA是内源的。

      结构：siRNA是双链RNA，miRNA是单链RNA。

      作用位置：siRNA可作用于mRNA的任何部位，miRNA主要作用于靶基因的3'-UTR区。

siRNA-靶基因敲低效率验证

细胞实验方法 Methods

转染效率对不同的细胞株和不同的转染试剂是不同的。我们仅以转染试剂LipofectamineTM 2000为例说明转染方法。为

了降低细胞密度、试剂用量，转染效率等因素导致的孔间差异，保证实验的可靠性和可重复性，我们建议：

        1.转染实验中每个转染样品至少设置3个复孔；

        2.转染实验分组设置建议：

                1）荧光对照siRNA组（检测转染效率）；

                2）空白对照组（不含转染试剂和siRNA）；

                3）转染试剂对照组（不含siRNA）；

                4）阴性对照siRNA组；

                5）阳性对照siRNA组；

                6）实验siRNA组；

        3.接种细胞时，每孔接种的细胞数量尽量保持一致，尽量使细胞在各孔的表面平均分布。

一、转染浓度

        1) 为了获得最佳基因阻断结果，每一种细胞系转染siRNA的量都需要经过实验确定。如果您是首次转染您的细胞系，

推荐尝试使用几个 LipofectamineTM 2000的浓度，并在20-100nM范围内改变siRNA的浓度，以确定达到最佳基因阻断

水平所需要的条件。高浓度的 siRNA可能具有细胞系依赖性。

        2) 在30-50％细胞汇合度时进行转染。通常基因沉默分析至少要在转染后24-72h进行。低密度转染细胞可以使转染

和分析之间更长的间隙更长，从而使由于细胞过度生长造成的细胞活性损害减少到最低。根据靶基因的特性，高密度转染

的细胞可能更加适合条件的优化。 

        3) 不要在转染时的培养基中加入抗生素，因为这将会降低细胞转染的效率和导致细胞死亡。

        4) 为获得更好的结果，可以使用Invitrogen的Opti-MEM 低血清培养基在形成复合物前稀释LipofectamineTM 2000

和siRNA。可以使用荧光标记的siRNA帮助优化细胞系的转染条件。一旦确定了用来转染的最佳条件，可以在每一次实验

都包括荧光标记siRNA，作为转染效率的指示剂。

二、转染步骤

        以LipofectamineTM 2000转染siRNA于24孔板，转染浓度为50nM为例，其他规格容器转染请参考表2。

        注:转染成功是siRNA 发挥作用的前提，寡核酸转染效率主要为细胞性质和转染方法所决定，需要选择对实验细胞转

染率高且毒性低的转染试剂和转染方法。

        1）接种细胞

        贴壁细胞：转染前24h，在400uL无抗培养基中接种0.5-2×105个细胞，转染时细胞融合度为50-70%。(注：铺板时要

将细胞消化完全、混匀，避免细胞堆积生长。)

        悬浮细胞：转染前24h，在400uL无抗培养基中接种0.5-2×105个细胞，转染时细胞数量应在4-8×105/孔。 

        注：需根据细胞的增殖速度、对转染的毒性反应以及检测时间等调整转染时的细胞密度，除特定实验  (如划痕实验等)外，

一般以到检测时间点时细胞未完全长满为宜。

        2）转染步骤

        A. 用50uLOpti-MEM稀释siRNA(转染细胞的终浓度为50nM)，轻轻吹吸3-5次混匀。

        B. 轻轻颠倒混匀转染试剂，用50uL Opti-MEM 稀释1.0uL LipofectamineTM 2000，轻轻吹吸3-5次混匀，室温下静置5min。

        C. 混合转染试剂和siRNA稀释液，轻轻吹吸3-5次混匀，室温下静置20min。

        注：混合液可室温放置一段时间，但不宜超过 24h

        D.转染复合物逐滴加入到24孔细胞板中，100uL/孔，前后轻摇细胞板混合均匀。

        注：转染复合物加入至原细胞培养基中一般无需移除或更换，  但亦可依据具体实验情况进行优化

        E.细胞板置于37℃、5%CO2培养箱中培养18-48h。转染4-6h后可换新鲜培养基。

表2 使用lipofectamine2000(invitrogen) 转染siRNA产品用量参考

V1：完全或不完全培养基；v2:Opti-MEM® I (无血清、无抗生素，转染专用)

注：表中数据仅供参考，对于部分细胞类型的转染试剂用量可进一步优化。

        3） 效果检测

        转染完成后24-72h均可进行siRNA沉默效果检测，最佳检测时间与细胞类型，转染试剂，检测目的等相关。

        1）RNA水平的检测：mRNA是检测siRNA 沉默效率的最佳指标，siRNA转染后24-72h即可检测到靶基因mRNA表达明

显降低，检测方法宜采用qPCR检测方法。

        注：引物设计质量很重要，需要确保检测引物有效性。

        2）蛋白水平的检测：蛋白是RNAi沉默效率的重要指标，其检测手段主要为Western Blot等。检测时间受细胞内蛋白质

表达量、半衰期等因素的影响，一般为 48-96h。

        3）功能筛选：应用EdU细胞增殖、EdUTP细胞凋亡等方法进行细胞功能筛选。

        对照转染图：

        敲低效率验证：