pLVX-LexA-EGFP-CD63 病毒

产品简介

          pLVX-LexA-EGFP-CD63，即Lentivirus expressing EGFP-CD63 fusion protein，是艾基自行研发的一种可以在大多数哺乳动物细胞(包括原代细胞和干细胞)中通过CMV启动子表达人源CD63-EGFP融合蛋白的重组慢病毒。本产品可用于外泌体的示踪研究，用于研究外泌体的形成、分泌、靶向和运输机制。本产品带有嘌呤霉素 (Puromycin)抗性基因，感染细胞后可以使用嘌呤霉素筛选稳定株。

          外泌体(Exosome)是膜包裹的细胞外囊泡(Extracellular vesicles, EVs)，直径约为40-160nm，具有脂质双分子层结构，天然存在于血液、尿液、脑脊液，以及体外培养细胞的上清液中[1]，几乎所有类型的细胞都可以产生并释放外泌体[2]。如图1所示，细胞膜内吞(Endocytosis)依次形成初级内体 (Early sorting endosome ESE)、次级内体(Late sorting endosome , LSE) 和多囊泡体(Multivesicular body, MVB) ，其中多囊泡体包含腔内囊泡(Intraluminal vesicles, ILVs) 。多囊泡体与细胞膜融合形成外泌体，外泌体携带多种来自其母体细胞的成分(包括核酸、蛋白质、脂类和代谢物等)释放到胞外基质中[3]。外泌体可以被附近或远距离的细胞识别和融合，是细胞间进行相互调控的重要媒介，参与了癌症、神经退行性病变和炎症性疾病等多种疾病的发病过程，影响细胞多方面的的功能[4-5]。

图1. 外泌体的形成原理及其携带的母体细胞成分示意图。

          外泌体标志蛋白（Protein biomarkers for exosome），也称外泌体蛋白标志物（Protein markers for exosome），可以用于鉴定、观察、标记和纯化外泌体。据外泌体库 ExoCarta（http://www.exocarta.org）统计，来自不同生物、细胞类型和体液的外泌体中已发现 9769 种蛋白质，ExoCarta 列出了 100 种常见外泌体蛋白标志物（http://exocarta.org/exosome_markers_new），其中 CD9、CD63、CD81、ALIX、Flotillin、Ceramidase 和 TSG101 是最常用的外泌体蛋白标志物（如图 2 所示）。CD63 在人体中由 CD63 基因编码的蛋白质抗原，是跨膜四超家族（Transmembrane 4 superfamily）成员之一，为中次跨膜蛋白 [1]，大量存在于细胞外囊泡的表面，也会出现在普通的细胞膜表面。CD63 是最常用的外泌体蛋白标志物之一，被认为是调控细胞外囊泡产生和胞内物质分选的关键因子 [6] 。

图2. 常见的外泌体蛋白标志物示意图。

Ø pLVX-LexA-EGFP-CD63感染HEK293T细胞后的表达效果如图3所示

TU                                                          1×10^5                                                          1×10^6

图 3. 艾基生产的pLVX-LexA-EGFP-CD63感染HEK293T细胞的效果图. 24孔板每孔100,000个细胞，

培养过夜后用相应的病毒TU数进行感染，病毒感染72小时后荧光显微镜实拍相同大小视野效果图。

实际检测效果会因检测仪器、实验条件的不同而存在差异，本图仅供参考。

          慢病毒感染细胞后会将目的基因随机整合到基因组 DNA 上，因而可以长期稳定地表达目的蛋白，并且几乎可以感染所有哺乳动物细胞，在很多不分裂的细胞中也可以长期稳定表达，广泛应用于细胞和动物实验。

          本产品表达慢病毒抗性基因，因此本产品感染培养的细胞后可以使用嘌呤霉素筛选稳定表达的细胞株以用于后续研究。

          艾基的 pLVX-LexA-EGFP-CD63是复制缺陷慢病毒。其 3’ LTR 的增强子功能发生缺失，形成了自失活（self - inactivating）3’ LTR，并且 5’ LTR 中的 U3 区域替换成 CMV 启动子，在感染普通的细胞后不能进行复制和扩增，从而有效降低了本产品在活体生物中的风险。

包装清单

保存条件

        -80ºC保存，一年有效。-20ºC保存，两周内有效。4℃保存，3天内有效。

注意事项

1. 收到病毒液后，如短期内需马上使用，请以 4°C保存(在 4°C保存条件下，病毒液请于一周内用完)；如需长期保存，则可分装后存放于-80°C 。一般病毒可存放于-80°C约 6~ 12个月(病毒置于冻存管，并使用封口膜封口) ，如保存 6个月后使用，请重新检测病毒滴度。

2. 使用前，请将病毒置于冰浴（或 4°C)中解冻。操作全程需将病毒置于冰盒中，保证低温以稳定其活性。

3. 我司提供的病毒以每管100μl，滴度在10⁸TU/mL以上进行定量分装，老师可根据实验加入不同的量使用。病毒冻融后可以按照实际使用情况进行再次分装，但一次冻融病毒滴度损失可能达 10 - 20%。分装后的病毒也应于-80°C乃至液氮保存。

4. 慢病毒的稀释：用户需要稀释病毒时，请将病毒取出置于4度融化后，使用1x PBS 或无血清的细胞基础培养基混匀稀释至合适滴度后进行细胞感染实验，稀释后的病毒在4°C保存条件下，三天内需要用完（不建议进行分装冻存）。

注意：应避免反复循环冻融慢病毒，这会导致病毒滴度大幅下降。

安全须知

        IGE 的慢病毒都是“ 自我失活”的，因为我们已从病毒基因组中删除了负责复制的基因，这也就意味着它们不能在靶细胞内复制并感染其他细胞。病毒仍然可以在理论上造成潜在的生物危害风险，因为它可以感染人类原代细胞，故我们强烈建议依照生物安全2级（BSL2级）标准要求处理病毒，生物危险废物贮存和处理方案必须与公布的标准相一致。

靶细胞感染方法

        我们建议您使用表达GFP的对照慢病毒来确定靶细胞的最佳感染复数（MOI）。MOI（Multiplicity of Infection，感染复数）是通常指每个细胞感染的最大病毒数；不同种类或不同来源的细胞，其最适MOI 各有差别。

        常见细胞MOI和感染条件可以参照附件1《常见细胞MOI和感染条件》内容，但由于不同实验室培养的细胞存在状态和培养条件的差异，第一次使用慢病毒时，建议先用对照慢病毒进行感染预实验，确定细胞最佳感染条件及MOI。

注意：

MOI值的计算：MOI值=加入病毒总数/细胞总数，如一个培养孔中细胞数为1×105个，加入 1×106TU的病毒时，侵染实验中MOI为10。

1、病毒感染贴壁细胞的实验（以12孔板为例）

实验前按照不同的MOI值设置不同的感染孔，并根据MOI值和细胞数量计算所需要的病毒量，如有必 要可以使用PBS溶液或者无血清培养基稀释病毒原液。

1.1 感染前一天（第 0 天）

将靶细胞进行传代铺板，使其在感染时达到 30-50％的汇合。铺板后将细胞置于37°C， 5% CO2 培养箱中孵育 18-20小时。例如，当使用293T细胞时，我们通常在 12 孔板中每孔接种 1.5× 105 个细胞。

1.2 感染当天（第 1 天）

将病毒从-80°C冰箱取出置于冰上解冻。根据所需的 MOI 取适量的病毒置于适量的培养基中，轻轻混匀（但不要涡旋）。为了最大限度地提高感染效率，可使用覆盖板表面所需的最少量培养基。例如，当在12 孔板中进行感染时，我们每孔使用 0.5ml 培养基。

注意：如果细胞容易被感染，开始以 MOI为1 到10 之间感染细胞。对于某些细胞系，可能需要更高的 MOI。

a. 从靶细胞中弃去旧培养基，然后将含有病毒的培养基加入细胞中。

b. 轻轻旋转平板，在 37°C ，5％CO2 培养箱中孵育4-6小时。

注意：感染前细胞的状态好坏对最终的感染效率高低影响很大，所以务必保证加病毒之前细胞处于良好的生长状态。慢病毒对目的细胞的感染效率较低时，通过提高MOI 值可以增加病毒的感染效率，但必须注意细胞的生长状态是否受到影响。

很多细胞在培养基中加入终浓度为5-10 µg/ml的Polybrene可以提高病毒的感染效率。Polybrene可以增强慢病毒的转染作用。Polybrene 是带正电的小分子，可以细胞表面的负电荷相互作用以增加病毒衣壳和细胞膜之间的结合。Polybrene 可能对某些细胞有害。您可能需要首先测试细胞对Polybrene 的敏感性，浓度为1-10μg/ml。对于大多数细胞类型，建议使用5μg/ml。

注意：过量接触 Polybrene（＞12 小时）可能对某些细胞有毒害性。

c. 孵育4-6小时后，吸去含病毒的培养液：用正常培养液或PBS小心洗细胞2-3遍，最后加入合适体积的培养液过夜。

1.3 感染第3天

从第3天开始，每天观察细胞，如载体带有荧光，则注意观察荧光，并关注细胞生长状态，如有必要进行换液，以保证细胞良好的生长状态。对于相关基因的检测可采用Real-time PCR或WesternBlot；也可加入含有抗生素的培养基进行药物筛选，每 2-3 天更换含有抗生素的新鲜培养基。

注意：具有强代谢能力的细胞如293T 和BHK21细胞系，在转染后24 小时则可表达荧光。然而，对于代谢缓慢的细胞如原代细胞、NSC 、MSC 等，GFP或mcherry等荧光的表达需要更长时间，因此可能在转染后 72-96 小时才观察到荧光。所以在此期间应及时更换培养基和传代细胞，确保细胞健康生长。